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この記事の内容：グラム染色による細菌の特定Ziehl-Neelsen染色テストの実行細菌の挙動と外観の調査すべての結果の解釈43参考資料
細菌の同定は複雑な作業です。理由の1つは、推定によると、世界中に10000〜10億の細菌種が存在することです。細菌の適切な同定は非常に重要です。特に医療分野では、病気の適切な治療は問題の原因となっている微生物の種類に大きく依存します。ほとんどの場合、識別は消去に基づいて行われます。細菌を識別するには、染色テストを実行し、その外観を分析し、さまざまな条件にどのように反応するかを観察する必要があります。迅速な結果が必要な場合は、DNAサンプルを採取して研究室に送ってください。
ステージ
方法1グラム染色により細菌を特定する
- 定めます 細菌がグラム陽性または陰性の場合。 グラム染色は、細菌をグラム陽性とグラム陰性という2つの最も一般的なタイプに分ける方法です。前者は、ペプチドグリカンと呼ばれるポリマーからなる厚い細胞壁を持ち、グラム陰性菌の薄い壁と同じように最高の染色性を示します。
- グラム陽性菌のいくつかの一般的なタイプは、連鎖球菌、ブドウ球菌、小球菌（または小球菌）およびリステリア菌です。
- グラム陰性菌の一般的な例を次に示します。ナイセリア、アシネトバクター、モラクセラ、腸内細菌科、ビブリオ、ヘモフィルス、フソバクテリウム、カンピロバクター。
- 適切な保護対策を講じてください。 テスト中に使用するバクテリアと化学元素は、健康にリスクをもたらします。染色テストを実施する際は、安全ゴーグル、使い捨てニトリル手袋、および白衣を着用してください。完了したら、手袋と他のすべての汚染物質を特別な袋に入れます。汚染された製品の袋を取り除くために、必ず研究所の手順に従ってください。
- ガラススライド上で観察するサンプルを置きます。 テストを開始するには、滅菌スライドにドロップまたは細菌標本を置きます。次に、3回点灯したブンゼンバーナーの上にブレードをスライドさせてサンプルを固定し、試薬をすすいだり追加したりするときにサンプルがプレートから出ないようにします。
- ブレードに5滴の紫色の結晶を加えます。 5滴のクリスタルバイオレット溶液をサンプルに注ぎます。サンプルがクリスタルバイオレットを吸収するまでしばらく待ちます。
- 衣服のピンでブレードを所定の位置に保持して、手を汚さないようにします。
- ブレードを徹底的に洗浄して、汚れを取り除きます。 タップまたはスクイーズボトルを使用し、水を最大5秒間ゆっくりと流して、サンプルに付着していないインクの残留物を除去します。
- 5滴のグラムダイオード染色液をスライドに注ぎます。 これは、ダイオード、重炭酸ナトリウム、二ヨウ化カリウムからなる溶液で、クリスタルバイオレットを細菌の細胞壁で溶かします。サンプルに5滴の溶液を注ぎ、1分間そのままにします。
- サンプルをアルコールまたは乳酸で洗浄します。 アルコールとラクトンは漂白剤であり、グラム陰性であれば細菌の細胞壁の染色を排除します。サンプルに数滴の漂白剤を注ぎ、3秒以内に機能させます。その後、これらの漂白剤を除去するために、5秒間水で優しくすすぐようにしてください。
- 漂白剤を長時間使用すると、グラム陽性菌の染色が消失し、偽陰性になる可能性があります。
- サフラニンを使用してコントラストテストを実行します。 サフラニンはクリスタルバイオレットとは対照的な赤色染料であるため、紫色の染色の影響を受けない細菌を着色します。サンプルに約5滴のサフラニンを注ぎ、1分間そのままにします。その後、水で5秒間優しくすすぎます。
- 1000倍の倍率でサンプルを視覚化します。 細菌はグラム陽性の場合は紫色または紫色になり、サフラニンのためにグラム陰性の場合はピンクになります。
方法2 Ziehl-Neelsen染色テストを実行する
- この手法を使用して、抗酸菌を検出します。 これらの種には脂質が多く含まれているため、グラム染色で使用される色素に対する耐性が高くなります。酸耐性菌は結核菌（M. tuberculosis）の原因菌を含むMycobacterium属に属します。耐酸性細菌を染色するには、酸性または硫酸溶液でのすすぎに耐性のある、カルボリックフクシンと呼ばれる赤色染料を使用する必要があります。
- 適切な保護対策を講じてください。 Ziehl-Neelsen染色中に使用される化学物質および生物学的物質は危険です。また、ブンゼンノズル、電気ヒーター、アルコールランプなどの熱源も使用する必要があります。以下の指示に従ってテストを実行してください。
- ゴーグル、ニトリル手袋、白衣を着用してください。
- 染料や漂白剤からの蒸気を吸い込まないように注意し、液滴が目や皮膚に飛び散らないようにしてください。フードの下で容器を開いたままにします。
- ブレードを温めるときは十分注意してください。使用される化学物質のほとんどは可燃性です。スライドまたはその他の機器に可燃性物質の痕跡がある場合もあります。
- ブレードを準備します。 円運動で、滅菌スライドの中心に少量の細菌サンプルを均等に広げます。サンプルは、約10 mm x 20 mmを占める必要があります。
- ブレードを乾かします。 試料を上に向けてブレードを乾燥構造の上に置きます。 30秒間自然乾燥させます。布でブレードを乾燥させないでください。
- サンプルを熱で固定します。 試料を上げた状態で、点灯したブンゼンバーナー上でブレードを2、3回スライドさせます。また、温度を65℃〜75℃に少なくとも2時間設定することにより、電気ヒーターにブレードを置くことができます。サンプルを沸騰または火傷しないように注意してください。
- ブレードに炭水化物フクシンを追加します。 この溶液をスライドに数滴注ぎます。サンプルを完全に覆うのに十分な量を注ぎます。
- ブレードを加熱して染料を固定します。 サンプルを上に向けて、ブンゼンバーナーまたはアルコールランプの上でスライドを慎重に暖めるか、電気ヒーターの上に置きます。ブレードを60°Cまで、または蒸気が放出し始めるまで加熱します。染料を5分間作用させます。
- 電気ヒーターを使用している場合は、60°Cでオンにしますアルコールランプまたはブンゼンバーナーを選択した場合、煙が発生することが予想されます。
- ブレードを希望の温度に5分間維持するには、断続的に温めます。
- サンプルを沸騰させたり、燃やしたり、乾燥させたりしないように注意してください。
- ブレードを冷水ですすいでください。 5分間冷まし、きれいな水で数秒間優しくすすぎます。水道水またはスクイーズボトルを使用して、サンプルに付着していない染料の染みを取り除きます。
- サンプルの酸性アルコールまたは硫酸を注ぎます。 体積で3％（v / v）のアルコールまたは20％の硫酸を使用して、サンプルを完全に覆います。色が薄くなり、非常に明るいピンクの色合いになるまで、酸を作用させます。通常、このプロセスには約10分かかります。
- きれいな水でブレードをすすぎます。 タップの下でブレードを優しく洗うか、スクイーズボトルを使用します。すべての酸と染料の残留物をよく取り除きます。
- 造影剤を追加します。 スライドをすすいだら、マラカイトグリーンまたはメチレンブルーの染料を注ぎます。これらの2つのソリューションは、青みがかったまたは緑がかった背景を作成し、その上に赤い染料、およびヒト細胞や非酸耐性細菌などの他の生物学的材料が現れます。物質を1〜2分間作用させます。
- ブレードをすすぎ、乾燥させます。 余分なコントラストを取り除くために水で徹底的にすすぐ。完了したら、乾いた布でブレードの背面を乾かし、スタンドで自然に乾かします。
- 1000倍の倍率でサンプルを視覚化します。 耐酸性細菌は赤または濃いピンクに変わります。他の細菌、非細菌細胞、および刃の根元は緑または青に変わります。
方法3細菌の行動と外観を研究する
- 細菌の形状を分析します。 細菌がグラム陽性、グラム陰性、または耐酸性であるかどうかを判断するために染色テストを実行した後、種をより正確に識別する時が来ました。まず、スライド上の細菌の形状を分析します。 3つの最も一般的な形式は、球菌（球形）、らせん、菌（棒状）です。
- これらの形式にはいくつかのバリエーションがあります。たとえば、丸い形の細菌（球菌）は、ペア（二重球菌）、チェーン、ヒープ、または4つのグループ（テトラッド）で現れることがあります。
- 細菌が好気性か嫌気性かを調べます。 細菌の2つのサンプルを取り、2つの別々の培養を作成します。月は嫌気性（酸素なしで成長）でなければならず、他方は好気性（酸素で成長）でなければなりません。成長を観察する前に、嫌気性培養物を少なくとも48時間、無酸素の場所に35°Cで保存します。
- バクテリアが酸素のない環境で成長し、酸素にさらされていない場合、それは嫌気性であることを意味します。
- それらは酸素のある環境で発達しますが、酸素の不在下では発達しませんが、好気性です。
- 両方の環境で発生する場合、通性嫌気性細菌について話します。
- 運動性テストを実行します。 細菌は、1つ以上の鞭毛と一緒に単独で移動できる場合、可動性です。運動性の程度は、特定の細菌種の特定において非常に重要です。運動にはいくつかのタイプがありますが、最も安全で最も読みやすい方法は半固体培地です。
- 運動性テストのための文化を作成します。 培養液で細菌の培養を準備します。以下の手順に従って、お好みのスープを準備してください。
- 運動性試験のために半固体寒天培地を接種します。 ブロス培養液の一部を滅菌接種針でコーティングします。テスト用に準備したTTCラガーなどの半固体ダガーチューブに慎重に針を植えます。針は寒天の2/3を貫通する必要があります。
- 完了したら、接種ゾーンの制限を超えないように注意しながら、慎重に針を取り外します。
- チューブを30°Cで48時間インキュベートします。
- テスト結果を読み取ります。 運動性試験の寒天は、細菌と接触すると赤に変わります。それらが可動性の場合、この赤またはピンクがかった色合いが物質全体に広がります。それ以外の場合、染色は注射部位に限定されます。
方法4すべての結果を解釈する
- コメントを収集します。 バクテリアの種類を知るには、培養から得られた情報、着色テスト、およびフォームの観察を収集する必要があります。患者のサンプルを検査している場合、それらが示す症状は、適切な細菌の種類を判断するのにも役立ちます。
- たとえば、細菌がグラム陰性、嫌気性、非運動性であることがテストで示され、患者の腹痛、悪心、嘔吐などの症状に気づいた場合、患者はバクテロイデス感染症に罹患している可能性があります。フラジリス。
- データベースを参照してください。 世界には数千種の細菌がいます。すべてを暗記することは不可能です。試験結果を細菌種に関する情報と比較するには、臨床微生物学の本またはオンラインデータベースを参照する必要があります。
- 細菌を識別するための優れたオンラインリソースがありますが、Patricbrc.orgやGlobalRPhなど、これらのデータベースのほとんどは英語で利用できます。ただし、INRA International Microbial Resource Center Webサイトで有用な情報を見つけることができます。
- 細菌の正確な種を知るために遺伝子検査を行います。 場合によっては、細菌種を特定する必要があります。最も迅速で簡単な方法は、DNAテストを実行することです。 DNAテストは、従来の染色と培養に耐性のある細菌を特定するのにも役立ちます。現在、微生物のDNAテストは非常に高速で、2時間以内に準備できます。
- 微生物の遺伝子配列決定を行う実験室にアクセスできない場合は、専門の機関に細菌サンプルを送付してください。